Immunity｜T细胞「集体自杀」真相曝光！郑大一附院张毅团队破解肿瘤微环境「死亡代码」PLPP1
英文标题：PD-1 signaling limits expression of phospholipid phosphatase 1 and promotes intratumoral CD8+T cell ferroptosis
中文标题：PD-1信号传导限制磷脂磷酸酶1的表达并促进肿瘤内CD8+T细胞铁死亡
发表期刊：Immunity
影响因子：25.5
客户单位：郑州大学第一附属医院
百趣提供服务：经典脂质组学、定量脂质组学、游离脂肪酸
研究背景
新陈代谢在机体对癌症的免疫反应中占据着至关重要的地位。肿瘤内葡萄糖、脂质和氨基酸代谢的改变，会对免疫细胞的抗肿瘤活性产生显著影响，进而推动肿瘤的发展进程。其中，脂质代谢不仅在调节细胞信号转导方面发挥着关键作用，还为细胞活动提供必要的能量支持，而脂质代谢过程中产生的脂质介质，能够从多个维度对免疫反应进行调控。肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)是一个极为复杂且代谢紊乱的环境。在这样的环境中，CD8+T细胞的脂质代谢出现异常。这种异常进一步加剧了CD8+T细胞的耗竭，使其在增殖能力和免疫功能方面表现不佳。磷脂作为众多细胞类型中含量最为丰富的代谢产物之一，在免疫反应中扮演着不可或缺的角色。它参与了多种免疫细胞功能的调节，对维持正常的免疫应答具有重要意义。
研究结果
1、瘤内CD8+T细胞中Plpp1的表达减少与抗肿瘤功能降低相关
研究者收集了5例肺癌患者的外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs)和肿瘤组织样本。相较循环活化CD8+(CD69+CD8+)T细胞，瘤内CD8+T细胞的脂质代谢发生改变：甘油磷脂占比最高（76%，图1A），包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)和心磷脂(CL)，其中PC和PE差异最大（图1B），表达减少（图1C）。PC和PE的合成主要由PLPP1催化，瘤内CD8+T细胞中的异常磷脂代谢可能受PLPP1控制（图1D）。在肺癌患者中，瘤内CD8+T细胞中的PLPP1 mRNA和PLPP1蛋白水平较循环CD8+T细胞的低（图1E-G）。相较于PLPP1hiCD8+T细胞，PLPP1loCD8+T细胞内干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达量低（图1H）。
基于GEO数据库中36例初治早期肺癌患者肿瘤组织的CD8+T细胞RNA测序的GSEA结果表明，PLPP1hiCD8+T细胞具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)再生，活性氧(ROS)代谢负调控的特征（图1I）。KEGG通路分析显示，PLPP1hi组DNA复制、细胞分裂和细胞周期的转录特征增强（图1J）。PLPP1表达与T细胞活化和细胞毒性特征基因的表达呈正相关，而与IFNGR1的表达呈负相关（图1K），后者同T细胞活化诱导的细胞凋亡相关。结果表明，PLPP1介导的瘤内CD8+T细胞磷脂代谢受损，从而触发CD8+T细胞功能障碍。
图1.瘤内CD8+T细胞中参与磷脂代谢和功能的PLPP1表达低
2、Plpp1缺陷通过铁死亡降低瘤内CD8+T细胞的细胞毒性功能
研究者进一步探究了Plpp1是否调控CD8+T细胞的行为。与Plpp1fl/fl小鼠相比，仅在T细胞区缺乏Plpp1的Lckcre-Plpp1fl/fl小鼠表现出更快的B16黑色素瘤生长速率（图2A）和更短的生存时间（图2B）。而当CD8+T细胞被耗竭时，二者的肿瘤生长和存活率相似（图2C-D）。在B16和Lewis肺癌(LLC)中，Lckcre- Plpp1fl/fl小鼠的CD8+T细胞数量较Plpp1fl/fl少（图2E）。将用eFluor 670染色的Lckcre-Plpp1fl/flCD8+OT1 T细胞和用CFSE染色的Plpp1fl/flCD8+OT1 T细胞激活、混合，转移到携带肿瘤的小鼠体内（图2F）。Plpp1缺失导致细胞分裂频率显著降低（图2G）。此外，与Plpp1fl/flCD8+OT1 T细胞相比，瘤内Lckcre-Plpp1fl/flCD8+OT1 T细胞内，抗肿瘤相关基因表达低，共抑制标志物表达高，活化标志物表达低（图2H-I）。这些结果表明，Plpp1的表达有助于CD8+T细胞的细胞毒性功能。
为了阐明潜在机制，研究者分析了B16肿瘤组织内浸润的CD8+T细胞的转录组数据。与Plpp1fl/flCD8+T细胞相比，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞内参与细胞铁死亡及细胞周期调节的基因表达上调，而有利于T细胞活化和存活的基因表达下调（图2J）。GO分析结果表明，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞显示出与氧化应激、氧化磷酸化和脂肪酸代谢相关的基因表达模式增强（图2K）。与Plpp1fl/fl相比，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞内与脂质过氧化或铁死亡激活相关的基因表达更高（图2L）。与氧化应激和铁死亡相关的基因在Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞中富集（图2M）。
研究发现，瘤内Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞的细胞死亡率高于瘤内Plpp1fl/flCD8+T细胞（图2N）。Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞的细胞死亡率仅在铁死亡抑制剂(ferrostatin-1)的作用下降低，而在细胞凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)或坏死性凋亡抑制剂(necrostatin-1)作用下不能（图2O）。Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞的功能和增殖也仅能被ferrostatin-1改善（图2P-Q）。为了确定铁死亡对T细胞抗肿瘤功能的影响，研究者使用铁死亡激动剂（FIN56和RSL3）培养Plpp1fl/flCD8+T细胞，发现CD8+T细胞的功能和增殖受到抑制，表明铁死亡抑制了CD8+T细胞的抗肿瘤功能。此外，研究者还用RSL3或ferrostatin-1处理阴性对照(NC)和Plpp1过表达(Plpp1-OE)OT1 CD8+T细胞，并将其注射到携带肿瘤的小鼠体内。体内实验显示，NC CD8+T细胞比Plpp1-OE CD8+T细胞有更高的细胞死亡率和更弱的抗肿瘤功能。在用ferrostatin-1处理后，NC CD8+T细胞实现了同Plpp1-OE CD8+T细胞相似的细胞死亡率和抗肿瘤功能。在用RSL3处理后，Plpp1-OE CD8+T细胞较NC CD8+T细胞表现出更低的细胞死亡率和更高的T细胞功能（图2R-S）。综上，研究强调Plpp1是CD8+T细胞铁死亡的重要调节因子，可影响T细胞抗肿瘤功能。
图2.Plpp1缺陷损害CD8+T细胞的存活和抗肿瘤反应
3、脂肪酸诱导Plpp1缺陷型CD8+T细胞的铁死亡
接下来，研究者检测了肿瘤内浸润的Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞的铁死亡。B16肿瘤中，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞的ROS水平和脂质过氧化高于Plpp1fl/flCD8+T细胞（图3A-B）。ROS有助于线粒体结构的变化。电子显微镜显示，大多数线粒体中的嵴在Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞中是无序的（图3C）。与Plpp1fl/flCD8+T细胞相比，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞中的线粒体面积更小，嵴长度更短（图3D-E）。
与肿瘤组织共培养后，Plpp1fl/fl和Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞均表现出更高的ROS水平及更高程度的脂质过氧化（图3F-G）。然而，与前者相比，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞更易于在与肿瘤组织孵育时诱导铁死亡（图3F-G）。脂肪酸是调控T细胞铁死亡的主要物质。B16肿瘤和LLC肿瘤的肿瘤间质液(TIF)内的游离脂肪酸(FFA)含量高于血清或脾脏（图3H）。基于此，FFA在肿瘤组织中积聚，可能诱导铁死亡。此后，研究者检查了脂肪酸对CD8+T细胞铁死亡和抗肿瘤功能的影响。结果发现，用5或10 μM脂肪酸处理的Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞比Plpp1fl/flCD8+T细胞有更高的ROS和脂质过氧化水平（图3I-J）。对Plpp1fl/flCD8+T细胞做类似处理后发现，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞的功能更弱（图3K-L）。以上表明，肿瘤部位积累的脂肪酸加剧了Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞的铁死亡。
图3.Plpp1缺陷加剧脂肪酸介导的CD8+T细胞铁死亡
4、不饱和脂肪酸促进Plpp1缺陷型CD8+T细胞的铁死亡
研究者推测肿瘤中诱导铁死亡的脂肪酸可能是不饱和脂肪酸。定量代谢组学结果显示，肿瘤中的不饱和脂肪酸含量高于脾脏（图4A），而几种饱和脂肪酸的含量较脾脏低（图4B）。
花生四烯酸(AA)和十八碳烯酸(OA)可诱导铁死亡。用AA或OA处理后，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞中含有AA或OA的PC和PE的差异倍数高于Plpp1fl/flCD8+T细胞内的（图4C-D）。在Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞中，AA和OA通过这些通路使铁死亡增加，T细胞受体信号通路、糖酵解和丙酮酸代谢减少（图4E-F）。数据表明，不饱和脂肪酸改变磷脂种类以诱导Plpp1缺陷型CD8+T细胞发生铁死亡。
研究者发现AA促进了T细胞死亡，Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞死亡率高于Plpp1fl/flCD8+T细胞。Ferrostatin-1能降低AA处理后的Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞的死亡率（图4G）。AA诱导的ROS水平和脂质过氧化在Lckcre-Plpp1fl/flCD8+T细胞中较Plpp1fl/flCD8+T细胞中高（图4H-I）。此外，研究者发现用Plpp1激动剂处理体外激活的CD8+T细胞后，AA诱导细胞死亡率、ROS和脂质过氧化的作用被抵消（图4J-L）。最后，构建了间皮素(MSLN) 靶向嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞和PLPP1过表达MSLN(MSLN-PLPP1)CAR-T细胞（图4M）。PLPP1过表达可增加CAR-T细胞中磷脂的水平（图4N-O），能更有效地抑制肿瘤生长（图4P），MSLN-PLPP1 CAR-T细胞的功能和增殖也得到了增强（图4Q-R）。总的来说，这些结果突出表明PLPP1是维持CD8+T细胞存活和正常功能所必需的。
图4.肿瘤中积聚的不饱和脂肪酸诱导Plpp1缺陷型CD8+T细胞铁死亡
5、PD-1信号抑制瘤内CD8+T细胞中Plpp1的表达
瘤内CD8+T细胞中的Plpp1表达下降，表现出铁死亡的特征。为了探索潜在的机制，研究者将CD8+T细胞与肺癌细胞共培养，发现CD8+T细胞中的PLPP1 mRNA表达下降（图5A）。将小鼠CD8+OT1 T细胞同黑色素瘤细胞B16过表达卵清蛋白(B16-OVA)共孵育，获得了类似的结果（图5B）。PD-1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)是主要的T细胞功能抑制因子。观察到当使用PD-1阻断抗体而不是CTLA4阻断抗体时，CD8+T细胞中PLPP1蛋白量的下调更少（图5C），因此推测PD-1信号可能调节PLPP1表达。
为了验证假设，重新分析了活化的人源CD8+T细胞(TACT)和TACT与PD-1信号激活剂程序性死亡配体1(PD-L1)Fc(TACT+PD-L1)共培养的RNA-seq数据集。同TACT组相比，TACT+PD-L1组PLPP1 mRNA表达减少（图5D）。成像流式细胞术证实，PD-L1 Fc诱导的PD-1信号激活下调了活化的CD8+T细胞中的PLPP1和IFN-γ水平（图5E）。此外，通过用IFN-γ培养MC38肿瘤细胞以增加PDL1的表达，然后固定PDL1并用于刺激PD-1信号通路。在与固定MC38肿瘤细胞共培养的CD8+T细胞中，脂质过氧化、ROS产生和细胞死亡率均增加，而它们都被PD-1阻断剂削弱（图5F-H）。这些结果表明，PD-1信号激活诱发T细胞铁死亡。
接下来，研究者将活化的OT1 T细胞经静脉过继性转移到携带B16-OVA肿瘤的小鼠体内（图5I）。与对照小鼠相比，抗PD-1治疗减缓了肿瘤生长（图5J），减少了肺中肿瘤结节的数量（图5K）。抗PD-1治疗增加了肿瘤组织中表达Plpp1、Ki67和IFN-γ的CD8+T细胞的占比（图5L-N）。此外，在抗PD-1治疗后，瘤内CD8+T细胞的细胞死亡率和脂质过氧化降低（图5O-P）。综上，这些发现表明PD-1信号的激活抑制了Plpp1表达，以致CD8+T细胞铁死亡。
图5.PD-1信号转导限制CD8+T细胞中Plpp1的表达，损害抗肿瘤免疫
6、GATA1受PD-1信号调节并限制PLPP1表达
PD-1介导的Akt通路参与调节T细胞的增殖和功能。研究者发现PLPP1hiCD8+T细胞表现出增强的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-Akt机制/哺乳动物雷帕霉素靶 (mTOR) 通路活性（图6A）。假设PD-1介导的Akt通路可能抑制PLPP1。磷酸化Akt(p-AKT)被PD-L1 Fc抑制（图6B）。用抗PD-1抗体处理后，TME中过继转移的CD8+OT1 T细胞中p-AKT占比增加（图6C），而Plpp1不影响p-AKT的百分比（图6D）。此外，使用激活的人源CD8+T细胞（有或没有PD-L1 Fc处理），创建RT2 profiler PCR阵列，监测能够控PLPP1表达的转录因子，最终鉴定出了14个转录因子（图6E）。使用PROMO网站确定了76个与PLPP1启动子区域结合的潜在转录因子。最后，综合以上结果，确定了五个转录因子(GATA1、E2F1、HNF1A、HNF4A、ARNT)。染色质免疫沉淀定量PCR (ChIP-qPCR)显示GATA1在PLPP1位点显著富集（图6F）。与对照组相比，Akt抑制剂处理组的GATA1结合富集增加（图6G）。PD-L1 Fc处理增加了GATA1的核转位，而加用PD-1阻断抗体处理后，该现象明显减少（图6H）。正如预期，Akt抑制剂抑制了小鼠活化CD8+T细胞中Plpp1蛋白表达，促进了GATA1的表达，并下调了白细胞介素(IL)-2和Ki67的表达（图6I-K）。在Akt抑制剂处理的CD8+T细胞中，GATA1的核转位增加（图6L）。
此外，为了评估GATA1对PLPP1表达和抗肿瘤功能的影响，构建了GATA1sh OT1 T细胞和T细胞过继转移肿瘤模型（图6M）。结果显示，GATA1sh组PD-1+CD8+T细胞中Plpp1蛋白量较NC组更高（图6N）。与NC组相比，GATA1sh中OT1 T细胞浸润和抗肿瘤功能更强（图6O-P）。以上表明，PD-1信号通过Akt-GATA1通路抑制Plpp1表达，导致CD8+T细胞功能障碍。
图6.PD-1诱导的GATA1与PLPP1启动子结合以改变PLPP1表达
7、Plpp1缺陷减弱了体内抗PD-1治疗的反应
研究者用Plpp1fl/fl或Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T细胞及PD-1阻断抗体或免疫球蛋白G(IgG)治疗B16-OVA肿瘤携带小鼠（图7A）。接受过继转移Plpp1fl/flOT1 CD8+T细胞，用PD-1阻断抗体处理的小鼠肿瘤比用IgG处理的长得慢；然而，接受过继转移Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T细胞，用IgG处理的小鼠与用PD-1阻断抗体处理的小鼠，肿瘤生长曲线类似（图7B）。TME中，PD-1阻断剂增加了Plpp1fl/flOT1 CD8+T细胞的频率，而Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T细胞占比没有增加（图7C）。此外，PD-1阻断增加了表达IFN-γ的Plpp1fl/flOT1 CD8+T细胞的百分比，但不增加Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T细胞的，表达IFN-γ的Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T细胞占比较Plpp1fl/flOT1 CD8+T细胞低（图7D）。
研究者从接受PD-1阻断抗体治疗的B16肿瘤中分离出浸润的CD8+T细胞，并进行了scRNA-seq测序。Plpp1fl/fl和Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T细胞表现出8个不同的簇（图7E）。Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T细胞主要集中在簇1、2和3，而簇0、4、5、6在Plpp1fl/flCD8+T细胞中富集（图7F）。基于T细胞亚型（幼稚/记忆、效应和耗竭）的标志物，聚类3被鉴定为幼稚簇，而聚类1表现出耗竭亚型。与铁死亡相关的标志物在第2簇中增加。簇0和6中有丝分裂相关基因的表达相对较高。簇4、5和7被鉴定为效应亚型（图7G）。超氧化物合成的NADPH氧化酶激活剂活性、氧化应激应对、细胞死亡调节和细胞脂质代谢过程在簇2中富集，表明抗PD-1治疗并没有减少Lckcre-Plpp1fl/flOT1 CD8+T细胞的铁死亡（图7H）。簇1中细胞死亡途径的负性调控降低。在第3簇中，繁殖和激活的相关途径减少，包括钙依赖性磷脂结合、氧化磷酸化和磷脂代谢过程（图7H）。
此外，研究者整合并分析了来自不同类型人类肿瘤的单细胞RNA测序数据。PD-1+CD8+T细胞的分析产生了10个簇（图7I）。簇3可能是一个高度增殖的亚群，其内PLPP1高表达（图7J）。使用来自GEO:GSE90730的转录组数据，可见PLPP1表达与抗PD-1治疗的响应基因增加呈正相关（图7K）。在36名食管癌患者（图7L）和58名晚期肺癌患者（图7M）中，CD8+T细胞中的PLPP1表达与Ki67表达高度相关。CD8+T细胞中的PLPP1表达与T细胞细胞毒性细胞因子相关（图7N）。在17名食管癌患者和35名晚期肺癌患者中，抗PD-1治疗促进了PLPP1的表达（图7O）。这些结果强调PLPP1赋予CD8+T细胞增殖和细胞毒性的能力，而这可以通过抗PD-1得到治疗性的恢复。
图7.Plpp1缺陷减弱了体内对抗PD-1疗法的反应
研究结论
该研究探讨了肿瘤微环境中CD8＋T细胞的磷脂代谢调控机制及其与PD-1信号通路的关联。研究发现，肿瘤内CD8＋T细胞的PLPP1表达显著下调，导致PC和PE合成减少，进而诱发铁死亡，削弱CD8＋T细胞的抗肿瘤功能。机制上，PD-1信号通过Akt-GATA1通路抑制PLPP1表达，而肿瘤微环境中积聚的不饱和脂肪酸（如花生四烯酸、十八碳烯酸）进一步驱动PLPP1缺陷型CD8＋T细胞发生铁死亡。体内实验表明，PLPP1缺陷会削弱抗PD-1治疗的效果，而恢复PLPP1表达可增强CD8＋T细胞对免疫治疗的响应。该研究揭示了PD-1信号通过调控磷脂代谢促进CD8＋T细胞铁死亡的新机制，为优化肿瘤免疫治疗策略提供了潜在靶点。
END
仲航 撰文
Tang 校稿